Quantitative Phase Imaging & Optical Diffraction Tomography

Quantitative Phase Imaging

Quantitative Phase Imaging (QPI) ist eine markierungsfreie Methode zur Quantifizierung der Phasenverschiebung von Proben, die den Brechungsindex (RI)-Kontrast entlang der Beleuchtungsachse integriert. QPI wird häufig mit digitaler Holographiemikroskopie (DHM) durchgeführt, und wir verwenden diese Methode, um die Trockenmasse und die durchschnittlichen RI-Werte einzelner Zellen in Suspension zu messen [1]. Dafür haben wir eine Analysepipeline entwickelt, die auf der Annahme kugelförmiger Objekte basiert [2,3].

QPI einer einzelnen Zelle. (a) Die schematische Zeichnung des Querschnitts entlang der optischen Achse veranschaulicht die Phasenverschiebung ∆Φ des Lichts, das durch eine Zelle hindurchgeht (Wellenfronten dargestellt als rote Linien). Die Phasenverzögerung wird durch den Brechungsindex (RI) der Zelle verursacht, der größer ist als der des umgebenden Mediums. Die Bilder in (b) und (c) zeigen Phasen- und Intensitätsbilder einer HL60/S4-Zelle. Abbildung reproduziert aus [4].

Optical Diffraction Tomography

Darüber hinaus verwenden wir Optical Diffraction Tomography (ODT). Mit dieser Methode kann man 3D-Brechungsindexverteilung (RI) innerhalb von Zellen quantitativ messen. ODT nutzt QPI-Techniken, um 2D-Phasenbilder aus mehreren Beleuchtungswinkeln aufzunehmen, die dann für die tomographische 3D-Rekonstruktion verwendet werden. Da der RI der meisten biologischen Proben linear proportional zu ihrer Massendichte ist, bietet ODT eine unverzerrte und markerfreie Ansicht der quantitativen Massendichteverteilungen in lebenden Zellen und Organismen.

Unsere Gruppe hat optische Aufbauten [5], Tomogramm-Rekonstruktionsalgorithmen [6] und theoretische Ansätze entwickelt, um die Massendichte mit dem RI verschiedener Substanzen in Beziehung setzen [7]. Diese Fortschritte wurden angewendet, um die Massendichteverteilungen in lebenden Zellen und Organismen zu untersuchen. Zu den bemerkenswerten Studien gehören die Untersuchung der niedrigeren Massendichte in Zellkernen im Vergleich zum Zytoplasma in adhärenten Zellen [8], Xenopus-Eizellextrakt und dessen mitotische Spindel [9,10] sowie Zellen unter osmotischem Stress [11]. Darüber hinaus haben wir die Massendichte von Proteinkondensaten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) erzeugt wurden, quantitativ charakterisiert [12] und signifikante Massendichteerhöhungen bei Hefen [13] und C. elegans-Larven [14] beobachtet, wenn sie in den Ruhezustand eintreten, um unwirtliche Umgebungen zu überleben. ODT wurde auch zur quantitativen Charakterisierung verschiedener interessanter Proben wie Zebrafisch-Larven [15], sowie Hydrogel-Mikrokügelchen [16] und -stäben [17] verwendet.

Funktionsprinzip von Optical Diffraction Tomography (ODT). (a) Schematische Übersicht eines ODT-Aufbaus unter Verwendung der Mach-Zehnder-Interferometrie. (b) Gemessenes, räumlich moduliertes Hologramm, das das komplexe optische Feld kodiert. (c) Erfasste optische Phasenverschiebungskarten von HeLa-Zellen, die aus verschiedenen Einfallswinkeln beleuchtet werden, und deren 2D-Fourier-Spektren. (d) 3D-Fourier-Spektren, wobei 2D-Fourier-Spektren aus verschiedenen Einfallswinkeln nach dem Fourier-Diffraktionstheorem abgebildet werden. (e) Das rekonstruierte RI-Tomogramm von HeLa-Zellen.

ODT-Messungen an verschiedenen biologischen Proben. (a, b) Das Epifluoreszenzbild (obere Reihe) und der Querschnitt eines RI-Tomogramms von (a) adhärenten HeLa-Zellen [8] und (b) einer Xenopus-Mitose-Spindel [9]. Der Querschnitt eines RI-Tomogramms von (c) einem Adipozyten [18] und (d) einem C. elegans-Embryo in der frühen Embryogenese [10].

Änderungen der Massenichte in C. elegans Larven im Ruhezustand (Dormanz). (a) Die Querschnittsbilder der RI-Tomogramme von C. elegans-Larven im Fortpflanzungszyklus (L3) und im Dauerstadium. Die Querschnittsbilder der RI-Tomogramme von C. elegans-Dauerlarven von (b) Kontrollgruppen und (c) lea-1-deletion-Mutanten nach starker Austrocknung (60 % relative Luftfeuchtigkeit). Abbildung reproduziert aus [14].

[1] M. Schürmann, J. Scholze, P. Müller, C. J. Chan, A. E. Ekpenyong, K. J. Chalut, and J. Guck, "Refractive index measurements of single, spherical cells using digital holographic microscopy," Methods Cell Biol. 125, 143–159 (2015).

[2] P. Müller, G. Cojoc, and J. Guck, "DryMass: handling and analyzing quantitative phase microscopy images of spherical, cell-sized objects," BMC Bioinformatics 21(1), 226 (2020).

[3] P. Müller, M. Schürmann, S. Girardo, G. Cojoc, and J. Guck, "Accurate evaluation of size and refractive index for spherical objects in quantitative phase imaging," Opt. Express 26(8), 10729 (2018).

[4] P. Müller, "Optical Diffraction Tomography for Single Cells," PhD Thesis, (2016).

[5] P. Müller, M. Schürmann, C. J. Chan, and J. Guck, "Single-cell diffraction tomography with optofluidic rotation about a tilted axis," 9548, 95480U (2015).

[6] P. Müller, M. Schürmann, and J. Guck, "The Theory of Diffraction Tomography," arXiv Prepr. 1507.00466, (2015).

[7] C. Möckel, T. Beck, S. Kaliman, S. Abuhattum, K. Kim, J. Kolb, D. Wehner, V. Zaburdaev, and J. Guck, "Estimation of the mass density of biological matter from refractive index measurements," Biophys. Reports 4(2), 100156 (2024).

[8] K. Kim and J. Guck, "The Relative Densities of Cytoplasm and Nuclear Compartments Are Robust against Strong Perturbation," Biophys. J. 119(10), 1946–1957 (2020).

[9] A. Biswas, K. Kim, G. Cojoc, J. Guck, and S. Reber, "The Xenopus spindle is as dense as the surrounding cytoplasm," Dev. Cell 56(7), 967-975.e5 (2021).

[10] A. Biswas, O. Muñoz, K. Kim, C. Hoege, B. M. Lorton, D. Shechter, J. Guck, V. Zaburdaev, and S. Reber, "Conserved nucleocytoplasmic density homeostasis drives cellular organization across eukaryotes," bioRxiv 1–81 (2023).

[11] C. Roffay, G. Molinard, K. Kim, M. Urbanska, V. Andrade, V. Barbarasa, P. Nowak, V. Mercier, J. García-Calvo, S. Matile, R. Loewith, A. Echard, J. Guck, M. Lenz, and A. Roux, "Passive coupling of membrane tension and cell volume during active response of cells to osmosis," Proc. Natl. Acad. Sci. 118(47), e2103228118 (2021).

[12] AJ. Guillén-Boixet, A. Kopach, A. S. A. S. Holehouse, S. Wittmann, M. Jahnel, R. Schlüßler, K. Kim, I. R. E. A. I. R. E. A. Trussina, J. Wang, D. Mateju, I. Poser, S. Maharana, M. Ruer-Gruß, D. Richter, X. Zhang, Y.-T. Y.-T. Chang, J. Guck, A. Honigmann, J. Mahamid, A. A. A. A. Hyman, R. V. R. V. Pappu, S. Alberti, and T. M. T. M. Franzmann, "RNA-Induced Conformational Switching and Clustering of G3BP Drive Stress Granule Assembly by Condensation," Cell 181(2), 346-361.e17 (2020).

[13] S. Abuhattum, K. Kim, T. M. Franzmann, A. Eßlinger, D. Midtvedt, R. Schlüßler, S. Möllmert, H.-S. Kuan, S. Alberti, V. Zaburdaev, and J. Guck, "Intracellular Mass Density Increase Is Accompanying but Not Sufficient for Stiffening and Growth Arrest of Yeast Cells," Front. Phys. 6, 131 (2018).

[14] K. Kim, V. R. Gade, T. V Kurzchalia, and J. Guck, "Quantitative imaging of Caenorhabditis elegans dauer larvae during cryptobiotic transition," Biophys. J. 121(7), 1219–1229 (2022).

[15] J. Kolb, V. Tsata, N. John, K. Kim, C. Möckel, G. Rosso, V. Kurbel, A. Parmar, G. Sharma, K. Karandasheva, S. Abuhattum, O. Lyraki, T. Beck, P. Müller, R. Schlüßler, R. Frischknecht, A. Wehner, N. Krombholz, B. Steigenberger, D. Beis, A. Takeoka, I. Blümcke, S. Möllmert, K. Singh, J. Guck, K. Kobow, and D. Wehner, "Small leucine-rich proteoglycans inhibit CNS regeneration by modifying the structural and mechanical properties of the lesion environment," Nat. Commun. 14(1), 6814 (2023).

[16] S. Girardo, N. Träber, K. Wagner, G. Cojoc, C. Herold, R. Goswami, R. Schlüßler, S. Abuhattum, A. Taubenberger, F. Reichel, D. Mokbel, M. Herbig, M. Schürmann, P. Müller, T. Heida, A. Jacobi, E. Ulbricht, J. Thiele, C. Werner, and J. Guck, "Standardized microgel beads as elastic cell mechanical probes," J. Mater. Chem. B 6(39), 6245–6261 (2018).

[17] Y. Kittel, L. P. B. Guerzoni, C. Itzin, D. Rommel, M. Mork, C. Bastard, B. Häßel, A. Omidinia‐Anarkoli, S. P. Centeno, T. Haraszti, K. Kim, J. Guck, A. J. C. Kuehne, and L. De Laporte, "Varying the Stiffness and Diffusivity of Rod‐Shaped Microgels Independently through Their Molecular Building Blocks," Angew. Chemie Int. Ed. 62(44), (2023).

[18] R. Schlüßler, K. Kim, M. Nötzel, A. Taubenberger, S. Abuhattum, T. Beck, P. Müller, S. Maharana, G. Cojoc, S. Girardo, A. Hermann, S. Alberti, and J. Guck, "Correlative all-optical quantification of mass density and mechanics of sub-cellular compartments with fluorescence specificity," Elife 11, (2022).

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